اسپکتروفتومتر با اندازه‌گیری میزان عبور نور از نمونه، جذب نوری آن را در طول موج مشخص تعیین می‌کند. از این اندازه‌گیری می‌توان برای محاسبهٔ غلظت یک ماده استفاده کرد؛ به شرط آنکه روش آزمون، آماده‌سازی نمونه و رابطهٔ میان جذب و غلظت مشخص باشد.
در آزمایشگاه‌های آب و فاضلاب، بسیاری از آزمون‌های اسپکتروفتومتری بر پایهٔ واکنش نمونه با معرف و تشکیل یک ترکیب رنگی انجام می‌شوند. انتخاب دستگاه مناسب به طول موج موردنیاز، روش آزمون، نوع سلول و محل انجام اندازه‌گیری بستگی دارد. دو مدل معرفی‌شده در سایت آرتین آزما، Hach DR1900 قابل‌حمل و Hach DR6000 آزمایشگاهی هستند.
اسپکتروفتومتر چگونه کار می‌کند؟
اجزای اصلی یک اسپکتروفتومتر شامل منبع نور، سامانهٔ انتخاب طول موج، محفظهٔ نمونه، آشکارساز و بخش پردازش و نمایش نتیجه است. آرایش اپتیکی و جزئیات این اجزا در مدل‌های مختلف تفاوت دارد.
منبع نور، تابش لازم را تولید می‌کند. سامانهٔ انتخاب طول موج، بخش مشخصی از این تابش را به سمت نمونه می‌فرستد. نور پس از عبور از سلول حاوی نمونه به آشکارساز می‌رسد و سیگنال حاصل برای محاسبهٔ عبور و جذب پردازش می‌شود.
عبور نوری از نسبت شدت نور عبوری به شدت نور مرجع به دست می‌آید:
T = I / I₀
جذب نوری نیز با رابطهٔ زیر تعریف می‌شود:
A = −log₁₀(T)
در این روابط، I شدت نور عبوری و I₀ شدت نور مرجع است. اگر عبور به‌صورت درصد گزارش شود، رابطهٔ جذب برابر است با:
A = −log₁₀(%T / 100)
در شرایط معتبر قانون بیر–لامبرت، جذب با غلظت و طول مسیر نوری رابطهٔ خطی دارد. بااین‌حال، برای نمونه‌های واقعی نمی‌توان بدون بررسی روش، هر مقدار جذب را مستقیماً به غلظت تبدیل کرد. واکنش شیمیایی، تداخل‌ها و محدودهٔ معتبر کالیبراسیون باید مشخص باشند.
تفاوت Hach DR1900 و DR6000
| ویژگی | Hach DR1900 | Hach DR6000 |
|---|---|---|
| نوع دستگاه | اسپکتروفتومتر قابل‌حمل VIS | اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی UV–VIS |
| محدودهٔ طول موج | ۳۴۰ تا ۸۰۰ نانومتر | ۱۹۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر |
| منبع نور | لامپ زنون فلاش | لامپ دوتریوم برای UV و تنگستن‌هالوژن برای ناحیهٔ مرئی |
| کاربرد در انتخاب دستگاه | اندازه‌گیری در محل و آزمون‌های سازگار با محدودهٔ دستگاه | آزمون‌های آزمایشگاهی با نیاز به محدودهٔ گسترده‌تر طول موج |
جدول ۱. مقایسهٔ مشخصات اصلی دو اسپکتروفتومتر Hach؛ جزئیات پیکربندی باید با مستندات همان مدل تطبیق داده شود.
مشخصات این جدول بر اساس برگهٔ فنی رسمی DR1900 و راهنمای رسمی DR6000 تنظیم شده است.
DR1900 برای چه کاری مناسب است؟
اسپکتروفتومتر قابل‌حمل Hach DR1900 برای اندازه‌گیری در محل قابل‌استفاده است. زمانی که انتقال نمونه به آزمایشگاه دشوار است، امکان اجرای آزمون سازگار در نزدیکی محل نمونه‌برداری می‌تواند در انتخاب آن مؤثر باشد.
محدودهٔ طول موج این مدل ۳۴۰ تا ۸۰۰ نانومتر است؛ بنابراین برای روشی که به طول موجی خارج از این بازه نیاز دارد مناسب نیست. سازگاری باید برای همان روش، معرف، محدودهٔ غلظت و سلول بررسی شود. صرف قرارگرفتن یک ویال در دستگاه، سازگاری کامل آزمون را تأیید نمی‌کند.
DR6000 چه تفاوتی دارد؟
اسپکتروفتومتر Hach DR6000 یک مدل آزمایشگاهی UV–VIS است. پوشش طول موج ۱۹۰ تا ۱۱۰۰ نانومتر و امکان اسکن طیفی، آن را برای بررسی‌هایی با نیاز به ناحیهٔ فرابنفش یا ثبت تغییرات جذب برحسب طول موج قابل‌استفاده می‌کند. راهنمای رسمی DR6000
گسترده‌تربودن محدودهٔ طول موج، به‌تنهایی به معنای دقیق‌تربودن نتیجهٔ هر آزمون نیست. کیفیت نتیجه به اجرای روش، وضعیت دستگاه، مواد مصرفی و کنترل کیفیت وابسته است.
انتخاب سلول و بلانک
سلول یا کووت باید از نظر جنس، ابعاد و طول مسیر نوری با دستگاه و روش آزمون سازگار باشد. برای اندازه‌گیری در ناحیهٔ UV باید از سلولی با عبور مناسب در طول موج موردنظر استفاده شود؛ هر سلول شیشه‌ای یا پلاستیکی برای این کار مناسب نیست.
سطوح نوری سلول باید تمیز و بدون اثر انگشت، قطره یا خراش مؤثر باشند. حباب در مسیر نور نیز می‌تواند نتیجه را تغییر دهد.
بلانک، مرجع اندازه‌گیری است و ترکیب آن را روش تعیین می‌کند. بسته به آزمون، ممکن است آب، حلال، نمونهٔ بدون معرف یا محلول آماده‌شده با معرف باشد. استفادهٔ همیشگی از آب مقطر به‌عنوان بلانک درست نیست.
مراحل عمومی انجام آزمون
مراحل زیر چارچوب کار هستند؛ حجم‌ها، زمان واکنش و تنظیمات باید از دستور همان آزمون برداشته شوند.
- روش و محدوده را انتخاب کنید. نام پارامتر، شمارهٔ روش، محدودهٔ غلظت، واحد و سازگاری معرف با مدل دستگاه را بررسی کنید.
- دستگاه و سلول را آماده کنید. راه‌اندازی و بررسی‌های اولیه را مطابق دفترچه انجام دهید. سلول و نگهدارندهٔ مناسب را انتخاب کنید.
- نمونه و بلانک را آماده کنید. حجم نمونه، مقدار معرف، ترتیب افزودن مواد، دما و زمان واکنش را رعایت کنید. اگر روش به هضم نیاز دارد، این مرحله باید پیش از قرائت انجام شود.
- بلانک را قرائت کنید. صفرکردن را طبق دستور روش انجام دهید. در صورت تغییر شرایط آزمون، نیاز به تکرار بلانک را بررسی کنید.
- نمونه را اندازه‌گیری کنید. سطح بیرونی سلول را تمیز و سلول را در جهت و موقعیت تعیین‌شده قرار دهید. قرائت را در زمان مجاز انجام دهید.
- نتیجه را کنترل و ثبت کنید. شناسهٔ نمونه، روش، واحد، ضریب رقیق‌سازی و نتایج کنترل کیفیت را همراه عدد نهایی ثبت کنید.
اگر غلظت خارج از محدودهٔ روش باشد، نتیجه نباید با برون‌یابی خودکار منحنی گزارش شود. رقیق‌سازی یا انتخاب محدودهٔ دیگر باید مطابق روش انجام گیرد.
کنترل عملکرد دستگاه با کالیبراسیون روش چه تفاوتی دارد؟
صفرکردن با بلانک، کنترل عملکرد دستگاه و کالیبراسیون روش، کارهای متفاوتی هستند.
بلانک برای تعیین مرجع اندازه‌گیری به کار می‌رود. کنترل عملکرد، ویژگی‌هایی مانند صحت طول موج یا پاسخ فتومتری دستگاه را بررسی می‌کند. کالیبراسیون روش نیز رابطهٔ پاسخ با غلظت مادهٔ مورداندازه‌گیری را تعیین می‌کند.
برای کنترل دستگاه باید از مواد یا فیلترهای مرجع مناسب، گواهی معتبر و حدود پذیرش مربوط استفاده شود. دستور کالیبراسیون یک مدل یونیکو را نمی‌توان بدون تأیید به DR1900 یا DR6000 تعمیم داد. همچنین تنظیم داخلی دستگاه نباید جایگزین بررسی علت مردودی آزمون کنترل عملکرد شود.
برای کنترل کیفیت نتایج، استاندارد کنترلی، بلانک روش، نمونهٔ تکراری یا آزمون بازیابی را بر اساس نیاز روش و برنامهٔ کیفیت آزمایشگاه انتخاب کنید.
چه عواملی نتیجه را تغییر می‌دهند؟
کدورت و ذرات معلق می‌توانند با پراکندگی نور بر اندازه‌گیری اثر بگذارند. رنگ زمینهٔ نمونه، واکنش‌های مزاحم، معرف نامناسب یا منقضی‌شده و رعایت‌نکردن زمان واکنش نیز از عوامل خطا هستند.
فیلتراسیون یا تصحیح رنگ نباید به‌صورت خودکار انجام شود؛ این اقدامات ممکن است ماهیت نمونه یا کمیت مورداندازه‌گیری را تغییر دهند و باید در روش مجاز باشند. آلودگی سلول، تفاوت طول مسیر نوری، انتخاب برنامهٔ اشتباه و واردنکردن ضریب رقیق‌سازی هم باید هنگام بررسی نتیجهٔ غیرمنتظره کنترل شوند.
کدام مدل را انتخاب کنیم؟
اگر اندازه‌گیری در محل لازم است و روش در محدودهٔ ۳۴۰ تا ۸۰۰ نانومتر اجرا می‌شود، DR1900 می‌تواند گزینهٔ قابل‌بررسی باشد. اگر روش به طول موج خارج از این بازه، ناحیهٔ فرابنفش یا اسکن طیفی نیاز دارد، باید قابلیت‌های DR6000 را با نیاز آزمون تطبیق داد.
انتخاب نهایی باید با فهرست آزمون‌های آزمایشگاه انجام شود: شمارهٔ روش، محدودهٔ غلظت، نوع نمونه، سلول، معرف و تجهیزات آماده‌سازی موردنیاز. وجود نام یک پارامتر در فهرست برنامه‌های دستگاه، به‌تنهایی اجرای معتبر آن را برای هر نمونه تضمین نمی‌کند.
تفاوت جذب، درصد عبور و غلظت در گزارش آزمایش
نمایش جذب روی دستگاه به این معنا نیست که غلظت ماده نیز مشخص شده است. جذب یک کمیت بدون بعد است که ممکن است در نمایشگر با Abs نشان داده شود. غلظت به یک رابطهٔ کالیبراسیون و واحد معین نیاز دارد. برای مثال، گزارش آهن بر حسب mg/L Fe با گزارش یک ترکیب آهن‌دار یکسان نیست. در آزمون‌های ترکیبات نیتروژن نیز مبنای گزارش اهمیت دارد؛ غلظت بر حسب نیتروژن را نباید با غلظت همان یون اشتباه گرفت. پیش از مقایسهٔ دو گزارش، نام کمیت و مبنای واحد را بررسی کنید.
مثال فرضی: اگر جذب نمونه‌ای ۰٫۳۰ باشد، از این عدد به‌تنهایی نمی‌توان نتیجه گرفت که غلظت آن ۰٫۳۰ میلی‌گرم بر لیتر است. تبدیل به غلظت به شیب و عرض از مبدأ منحنی، شرایط واکنش و در صورت لزوم ضریب رقیق‌سازی وابسته است. همچنین تعداد رقم‌های نمایشگر با تعداد رقم‌های معتبر نتیجه برابر نیست. گزارش رقم‌های اضافی، دقت واقعی روش را افزایش نمی‌دهد. تعداد اعشار باید با عملکرد روش و شیوهٔ گزارش آزمایشگاه هماهنگ باشد.
برنامهٔ آمادهٔ دستگاه چه چیزی را مشخص می‌کند؟
برنامهٔ ذخیره‌شده معمولاً تنظیمات لازم برای تبدیل پاسخ نوری به نتیجهٔ یک روش مشخص را در اختیار کاربر می‌گذارد. وجود این برنامه جای خواندن دستور آزمون را نمی‌گیرد. ممکن است یک پارامتر با چند روش، چند معرف و چند محدودهٔ اندازه‌گیری تعیین شود. انتخاب نام پارامتر بدون کنترل شمارهٔ روش و محدوده می‌تواند نتیجه‌ای ظاهراً معتبر اما نادرست ایجاد کند. نسخهٔ برنامه و سازگاری آن با کیت مصرفی نیز باید در دستور کار آزمایشگاه مشخص باشند.
پیش از خرید مواد مصرفی، فهرست آزمون‌ها را به همراه شمارهٔ کاتالوگ معرف و نوع سلول تهیه کنید. نیاز به راکتور هضم، پیپت، ظروف آماده‌سازی یا نگهدارندهٔ مخصوص را جداگانه بررسی کنید. دستگاهی که مرحلهٔ قرائت را انجام می‌دهد، لزوماً تمام تجهیزات اجرای آزمون را در خود ندارد. برای روش‌های سفارشی هم باید محدودهٔ کاری، کالیبراسیون، کنترل کیفیت و محدودیت ماتریس پیش از استفادهٔ معمول ارزیابی شوند. دستور شیمیایی یک آزمون را نمی‌توان صرفاً با تغییر طول موج به روش معتبر دیگری تبدیل کرد.
آماده‌سازی نمونه و زمان اندازه‌گیری
نمونه‌برداری بخشی از اندازه‌گیری است. ظرف نامناسب، تأخیر در آزمون یا نگهداری نادرست ممکن است ترکیب نمونه را تغییر دهد؛ در چنین شرایطی سالم‌بودن دستگاه مشکل را جبران نمی‌کند. نوع ظرف، شرایط نگهداری و حداکثر زمان مجاز تا آزمون باید از روش همان پارامتر استخراج شوند. برای همهٔ آزمون‌ها یک دمای نگهداری، زمان انتظار یا مادهٔ نگهدارندهٔ مشترک وجود ندارد. اطلاعات محل برداشت و زمان نمونه‌برداری نیز باید همراه نمونه باقی بمانند.
در واکنش‌های رنگ‌سنجی، زمان افزودن معرف و زمان قرائت را ثبت کنید. اگر روش زمان مشخصی برای تشکیل یا پایداری رنگ تعیین کرده است، قرائت زودتر یا دیرتر قابل جایگزینی با قرائت استاندارد نیست. حجم‌های کم به ابزار حجمی مناسب و روش پیپت‌کردن صحیح نیاز دارند. اختلاط ناکافی می‌تواند باعث تفاوت پاسخ بخش‌های مختلف محلول شود. در عین حال، تکان‌دادن شدید نیز ممکن است حباب ایجاد کند؛ شیوهٔ اختلاط باید با دستور آزمون سازگار باشد.
رقیق‌سازی و محاسبهٔ نتیجهٔ نهایی
رقیق‌سازی باید با حلال مجاز و ابزار حجمی مناسب انجام شود. رقیق‌کردن همیشه تداخل را به‌طور کامل برطرف نمی‌کند و ممکن است غلظت را به محدوده‌ای نزدیک حد اندازه‌گیری برساند. پس از رقیق‌سازی، پاسخ باید در محدودهٔ معتبر روش قرار بگیرد. اگر دستور آزمون محدودیتی برای رقیق‌سازی دارد، همان محدودیت مقدم است. نتیجهٔ مربوط به محلول رقیق‌شده و نتیجهٔ مربوط به نمونهٔ اولیه باید در برگهٔ کار از هم قابل تشخیص باشند.
مثال فرضی: اگر ۱۰ میلی‌لیتر نمونه را به حجم نهایی ۵۰ میلی‌لیتر برسانیم، ضریب رقیق‌سازی برابر ۵ است. اگر دستگاه برای محلول رقیق‌شده ۲ میلی‌گرم بر لیتر نشان دهد و ضریب را قبلاً اعمال نکرده باشد، غلظت نمونهٔ اولیه ۱۰ میلی‌گرم بر لیتر خواهد بود. اعمال دوبارهٔ ضریب در دستگاه و سپس در محاسبات دستی، نتیجه را اشتباه می‌کند. شیوهٔ ثبت ضریب و محل اعمال آن باید در دستور کار روشن باشد.
برنامهٔ عملی کنترل کیفیت نتایج
پیش از شروع یک سری آزمون، معیار پذیرش کنترل‌ها را مشخص کنید. استاندارد کنترلی با مقدار معلوم برای بررسی نتیجه مفید است، اما پذیرش آن به محدودهٔ تعیین‌شده در روش یا برنامهٔ کیفیت وابسته است. انتخاب یک درصد ثابت برای همهٔ پارامترها و همهٔ غلظت‌ها قابل دفاع نیست. استاندارد باید از نظر مقدار، ماتریس، تاریخ اعتبار و شرایط نگهداری متناسب باشد. اگر کنترل مردود شد، تکرار قرائت تا رسیدن به یک عدد مطلوب، جای بررسی علت را نمی‌گیرد.
نمونهٔ تکراری به بررسی پراکندگی نتایج کمک می‌کند. افزودن مقدار معلوم آنالیت به نمونه نیز می‌تواند برای بررسی بازیابی و اثر ماتریس به کار رود، به شرط آنکه روش این کار را پشتیبانی کند. قبولی استانداردی در آب خالص، نبود تداخل در پساب واقعی را تضمین نمی‌کند. بررسی‌ها و تصمیم‌های اصلاحی باید ثبت شوند تا معلوم باشد کدام نتایج پس از مشاهدهٔ مشکل نیازمند ارزیابی مجدد هستند. راهنمای Hach دربارهٔ بررسی صحت رنگ‌سنجی نیز بر تفکیک اثر دستگاه، معرف و نمونه تأکید دارد.
عیب‌یابی نتیجهٔ غیرمنتظره
وقتی نتیجه با انتظار سازگار نیست، ابتدا خطاهای قابل مشاهده را کنترل کنید: شناسهٔ نمونه، انتخاب برنامه، واحد، نوع سلول، تمیزی سطح و ضریب رقیق‌سازی. سپس تاریخ و شرایط نگهداری معرف، مراحل واکنش و آماده‌سازی را بررسی کنید. اگر بلانک غیرعادی است، علت را پیش از ادامهٔ کار مشخص کنید. کسر دلخواه یک عدد از همهٔ نتایج یا تغییر ضرایب برنامه برای نزدیک‌کردن پاسخ به انتظار، راه اصلاح معتبر نیست.
اگر چند نمونه و کنترل به‌صورت هم‌زمان دچار تغییر شده‌اند، احتمال یک عامل مشترک را بررسی کنید. اگر فقط یک نمونه مشکل دارد، ویژگی همان نمونه و تداخل احتمالی اهمیت بیشتری پیدا می‌کند؛ این یک مسیر بررسی است و به‌تنهایی تشخیص قطعی نیست. نتیجهٔ خام، زمان وقوع مشکل و اقدام‌های انجام‌شده را نگه دارید. تغییر تنظیمات، تعویض معرف و تمیزکاری هم‌زمان، تشخیص علت اصلی را دشوار می‌کند؛ هر اقدام را با ثبت نتیجهٔ آن ارزیابی کنید.
نگهداری و ثبت سوابق دستگاه
تمیزکاری بدنه، محفظهٔ نمونه و سلول باید با مواد و روش مجاز سازنده انجام شود. ریختن معرف داخل محفظه را نباید تنها با ادامهٔ قرائت نادیده گرفت. پیش از هر اقدام، دستور برخورد با آلودگی را بررسی کنید. بازکردن بخش‌های داخلی یا دست‌کاری اجزای اپتیکی بخشی از نظافت روزمره نیست. برنامهٔ سرویس و تعویض قطعات نیز باید به دفترچهٔ همان مدل، وضعیت دستگاه و توصیهٔ خدمات فنی متکی باشد.
سوابق مفید شامل تاریخ سرویس، پیام‌های خطا، نتایج کنترل عملکرد و هر تغییر اثرگذار بر اندازه‌گیری است. پس از تعمیر یا جابه‌جایی مؤثر، مناسب‌بودن دستگاه برای کار موردنظر را طبق برنامهٔ آزمایشگاه بررسی کنید. برای هر دو مدل DR1900 و DR6000، دستورهای اختصاصی باید از مستندات همان مدل برداشته شوند. زمان گرم‌شدن، آزمون نور سرگردان یا روش تصحیح طول موج یک دستگاه دیگر را نمی‌توان بدون بررسی به این مدل‌ها منتقل کرد.
پرسش‌های متداول دربارهٔ اسپکتروفتومتر
آیا DR1900 جایگزین کامل DR6000 است؟
خیر. محدودهٔ طول موج و نوع کاربرد این دو مدل یکسان نیست. اگر روش به طول موجی خارج از بازهٔ DR1900 نیاز داشته باشد، این مدل مناسب آن روش نیست. حتی در محدودهٔ مشترک، تطبیق معرف، سلول و برنامهٔ آزمون لازم است. مقایسه باید برای یک روش مشخص انجام شود، نه صرفاً بر اساس نام دستگاه.
آیا هر نتیجهٔ تکرارپذیر، صحیح است؟
خیر. ممکن است چند قرائت به هم نزدیک باشند، اما همگی تحت تأثیر یک خطای مشترک قرار گرفته باشند. انتخاب برنامهٔ اشتباه یا بلانک نامناسب می‌تواند چنین وضعیتی ایجاد کند. برای ارزیابی صحت باید از کنترل متناسب و مقدار مرجع استفاده شود؛ تکرار قرائت تنها بخشی از بررسی کیفیت است.
آیا از روی رنگ نمونه می‌توان روش را انتخاب کرد؟
رنگ ظاهری برای انتخاب روش کافی نیست. باید مادهٔ هدف، محدودهٔ غلظت، واکنش موردنظر و تداخل‌ها مشخص باشند. نمونهٔ رنگی ممکن است جذب زمینه داشته باشد و به تصحیح مجاز در روش نیاز پیدا کند. انتخاب طول موج یا بلانک بر اساس حدس، نتیجهٔ قابل اتکا ایجاد نمی‌کند.
برای بررسی تناسب دستگاه چه اطلاعاتی لازم است؟